2022年2月15日,临研所举办了题目为“显微切割·10X单细胞测序探索细胞奥秘”的学术讲座。讲座由杨鑫、王在和邓博老师组织举办。

基于单细胞的组学技术对于细胞异质性的研究十分关键。由于单细胞技术的带动,精准医疗和个性化医疗进入了一个崭新的、日趋激动人心的时代。从2010年单细胞转录组测序技术出现以来,各种针对单个细胞的转录组、基因组、表观组等研究层出不穷,呈现出爆炸式发展的趋势,迅速成为当前生物医学研究领域最为火热的技术手段和分析方法之一。本讲座选择了单细胞研究领域的两个关键技术,即显微切割技术和10X单细胞测序技术,讲解了相关仪器的原理和应用。

首先,基因有限公司市场部赵黎明经理为大家讲解了MMI激光显微切割的原理和应用方向。激光显微切割系统可以方便快捷地将目的细胞从经染色的组织切片中分离下来,如混杂在肿瘤组织中的肿瘤细胞,从而获得单一类型的同质细胞,使后续的基因组、转录组、蛋白质组等水平的研究更加精细、准确。对于不能染色的样本,可采用“三明治”式的样本处理方法,将相邻切片进行染色,从而确定未染色切片中的切割区域。在靶细胞收集方面,收集管盖分区、主动式粘附采集等特点保证了实验结果的高度可靠性和可重复性。另外,单细胞捕获技术可以通过对培养皿中贴壁细胞粘附的内置薄膜进行圈取和切割,实现对贴壁生长活细胞的选择和分离,后续可继续培养扩增或测定分析。对于悬浮细胞,可通过自动吸管技术对稀有样本中的靶细胞进行全自动的单细胞吸取及转移,代替传统口吸管技术,为单细胞研究领域带来重要革新。综上,基于激光显微切割技术的低起始量空间多组学分析方法,可将多组学信息和空间信息相整合,为研究和诊断提供宝贵的见解。

接下来,北京怡美通德科技发展有限公司10XGenomics产品应用技术支持惠建成老师讲解了10X单细胞测序技术。该技术基于微流控原理,用油包水的方法将单个细胞与包被有捕获序列的胶珠包裹在一起,制备成单细胞胶珠(GEMs)。捕获序列中含有条形码(barcode)序列、UMI(uniquemolecularidentifier)序列和反转录引物序列等。条形码序列含有16个nt,每个GEM有独特的条形码序列,用于区分测得序列的不同细胞来源;UMI序列含有12个nt,用于区分不同起始转录本。反转录引物序列poly(dT)与mRNA3'端polyA结合,借助GEM中的反转录试剂成分,在每个GEM中进行反转录。随后,油滴破乳,cDNA被收集到一起,经PCR扩增及高通量测序分析,完成单细胞基因表达的测定和相关分析。

该技术可揭示在单细胞水平上的基因表达差异,并识别来自组织或混杂细胞的异质性样本中罕见的细胞类型;在不了解细胞亚型或细胞标志物的情况下对细胞群体进行表征,定义新的细胞类型和细胞状态,为特定细胞亚群发现新的生物标志物,以及分析和理解细胞异质性及其对生物系统的贡献。

10X单细胞捕获系统18分钟时间内可捕获500-80000+个细胞,可同时进行1-8个样本的处理,从细胞悬液到测序所需cDNA文库的整个流程可在一天内完成;最高65%的细胞捕获效率;可兼容Illumina®HiSeq®4000/2500/NextSeq®/NovaSeq®测序系统。

此外,该系统通过捕获BCR或TCR序列,构建5'基因表达文库,可实现覆盖VDJ可变区的免疫组学测序分析;通过捕获偶联寡核苷酸标签的抗体蛋白,可同时完成单细胞中蛋白组学的分析;通过捕获gRNA序列,实现单细胞水平的CRISPR筛选,为几百到几万个细胞的分析鉴定提供了一种全面的、可扩展的解决方案,在免疫学研究、癌症研究、神经科学研究、发育生物学及干细胞研究中起到划时代的推动作用。